地址:

您现在的位置 : 包膜病毒

包膜病毒

也会发生充血性心衰

  上面介绍的是针对贴壁细胞的感染方法,若是悬浮或半悬浮细胞,则需要通过平角离心转染法,即将适量的病毒液加入细胞培养皿后,封好口,放入平角离心机后,低速离心1h,然后放入培养箱中正常培养即可。若由于实验条件有限,没有平角离心机,可用离心管代替,将细胞吹打吸入离心管中,进行低速离心,去掉大部分上清,然后加入适量的病毒液,室温放置10min(不能超过半小时),然后将细胞和病毒液同时吸出转入培养皿中继续病毒感染至2小时后换液即可。

  需要稀释病毒时,将病毒取出后置于冰上融解,使用培养目的细胞用PBS或培养基稀释到所需浓度后混匀分装后4℃保存,并尽快用于实验(尽量一周内用完),动物实验建议使用注射用平衡液来稀释,并尽快用完。

  事先准备好用于包装病毒的293A细胞和病毒质粒,转染每个直径为6cm的培养皿complex成分如下:

  5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液(70%完全培养基+20鸖+10%DMSO),重悬细胞,密度为3?x106个/ml。

  如带有GFP等荧光标签,24h后可观察到荧光,36h可达到表达高峰,若不带有荧光标签,则需要鉴定

  1)24板长满了细胞大约有3×105个细胞。?如果一天后要长到70%(2.1×105),?建议1.2-1.4×105个细胞。因为细胞刚放进去的前几个小时需要粘在生长表面及适应新的生长条件,不会达到24小时翻一倍的速度。其他规格培养可参照此确定相应culture细胞量。

  有时需要,但是根据具体情况操作,因为助转剂,如polybrene,对细胞的伤害比较大,有的细胞可能承受不了

  空斑形成单位(PFU)的测定:293细胞铺于60mm?dish,24h后细胞接近长满,加入不同稀释度的病毒,37℃感染2小时后,铺8ml低熔点胶(5%FBS,1.25%Agarose)。9天左右计数。上述操作中在最低浓度的培养皿中挑取病毒空斑,可以用来纯化病毒。

  注:LipoFiterTM转染试剂为汉恒生物产品,使用说明参考LipoFiterTM说明书。

  将纯化过的腺病毒以每只小鼠?1-5×109毒量注射,比如纯化腺病毒滴度为?1×1011PFU,则每只小鼠注射体积约为?10-50ul。具体的注射量需要实验摸索,注意注射体积不要超过?200ul,最好控制在100ul以下,注射剂量过多,也会发生充血性心衰。

  有时需要,但是根据具体情况操作,因为助转剂,如polybrene,对细胞的伤害比较大,有的细胞可能承受不了

  汉恒生物技术(上海)有限公司是知名的慢病毒载体技术研究企业,专注于慢病毒包装、腺相关病毒技术的研发与应用转化的技术服务公司

  6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。

  带有GFP等荧光标签,24h后可以观察到表达,36h达到高峰,若不带有荧光标签,则不可直接观察到,需要鉴定

  当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态。

  3、细胞计数,将细胞全部晃下,加入?3mL?37℃?预热的10%DMEM,用10mL?移液管进行吹打,较大力吹打?6-8?次即可,不留死角,之后,将所有细胞吸出,置于15mL?离心管中,取?50ul?混匀后的细胞于?1.5mLeppendorf管中,加入?450ul?10%?DMEM,即为10倍稀释,混匀,取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格,每大格16小格。计数时,4大格均计数,总数除以4(得每大格细胞数),再乘以10(10倍稀释),即?为实际n万/mL细胞浓度。

  500ul?PBS重悬病毒沉淀,一周内使用则置于4度冰箱保存,如需长时间存放需


下一篇:没有了