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包膜病毒

本文着重介绍以下两种方式的大规模制备:贴壁细胞扩展法(增加生

  超速离心法是借助超速离心机根据物质的沉降系数,质量、密度等的不同,应用强大的离心力使病毒分离、浓缩和提纯的方法。

  大多数操作规程的最后步骤是采用0.2um的膜过滤,这是在GMP条件下降低最终产品微生物污染风险的标准法规要求。虽然强烈推荐无菌过滤,但前提是该过程必须被证明是完全无菌的。这就需要无菌工艺验证,这是通过介质的工艺实验来完成,该操作必须在符合Class100(美国)或Grade A(欧盟)标准的环境内进行。

  用磷酸钙沉淀的DNA转染悬浮细胞由于持续的搅拌而被认为效率低下。因此,大多数时候采用其它的转染试剂如阳离子聚合物。线中诱导最高的转染效率,用GFP质粒作为报告质粒可以达到75%的转染效率。

  细胞状态和质粒转染过程决定了病毒的产量,而病毒的纯化方法则决定了病毒的得率和病毒的质量,不同的实验室可根据自身的硬件条件及实验需求选择合适的纯化方案。

  报道的用于慢病毒下游处理的技术总结在Table 3中,各个研究团队之间最大的差异是靶分子捕获阶段,Scherr、Yamada 、 Slepushkin、Bellintani、Merten 、Greene等证实可以用阴离子交换色谱来纯化VSV-g包被的慢病毒,而大规模纯化步骤是基于低压柱层析或基于膜的阴离子交换层析。当被用作第一步纯化时,这种膜盒可以最多每天纯化1500L样品。扩大规模可以直接获得纯的慢病毒(如去掉超过98%污染的蛋白和DNA);然而,慢病毒的复性并不像超离那样高效。色谱基质的低回收率是由于LV脆性施加的限制性工艺条件所致。事实上,慢病毒对pH变化及高盐浓度非常敏感,而这两个指标正是离子交换色谱优化结合和洗脱脱条件经常改变的。

  II. 中间纯化包括在捕获和优化阶段对澄清的粗产品进行的步骤,这些步骤去除特定的杂质;

  超滤浓缩分离技术,是根据分子的大小来分离溶液中大分子和小分子物质,超滤离心管通过离心力,使溶液中的小分子溶液和溶剂通过滤膜,而大分子溶质则被截留在样品管中。

  该纯化方法的特点:设备要求低,操作简便,非特异结合,PEG残留易至细胞融合甚至死亡。

  基本流程:将含慢病毒上清液和PEG8000(或者4000,6000)按比例充分混合。4℃离心5000rpm*20min,用1mL或更少体积的病毒存储液重悬沉淀,浓缩至1ml或更少体积。收集后过滤除菌用于后续实验。

  目前,通用的慢病毒包装系统有三质粒和四质粒系统,四质粒系统在的安全性上更好点,而经典的三质粒系统的在操作性及病毒滴度上更胜一筹。

  腺相关病毒(AAV)是一种复制缺陷型细小病毒,其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低,在体内表达外源基因时间长,具有明显的组织噬性等特点,这使rAAV成为用于基因转移和基因治疗的一个非常有吸引力的工具载体。

  虽然转染贴壁细胞是生产慢病毒的金标准方法,但是这个方法在扩大规模上受限。对工业化生产来说,在大的生物反应器中培养细胞通常是最便捷的方式。

  最后,有一个大规模纯化工艺没有最后的无菌过滤步骤,因为该生产工艺是在


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