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包膜病毒

已介绍过通过基于流式细胞术的基因转移分析技术(GTA)测定功能

  通过稳产细胞株(clone 92),我们制定了两种在灌流高产实验方案。第一种方法使用基础培养液SFM4TransFx293和灌流模式来增加细胞密度和病毒载体回收(图3A-B和5A-B)。第二种方法中使用补加CB5的HyCell TM TransFx-H培养液:由于在诱导后才开始使用灌流模式,因此该方法可能简单更操作(图3C-D和5C-D)。总之,与分批模式相比,灌流模式可将病毒的总产量提高至15倍。尽管预期8×1010 TU / L的绝对病毒滴度是转基因依赖性的,但是我们推测与分批模式相比,超过1个对数的产量将可转移到其他转基因。

  此前已经介绍了一款包装细胞系,此细胞系除了病毒RNA外含有包装慢病毒的所有必需基因。此包装细胞系名为PacLV,是在单次转染操作中同时加入所有LV组分(Gag / Pol,Rev和VSV-G)。在包装细胞中,Rev和包膜蛋白(VSV-G)的转录处于四环素和cumate开关的控制下,这意味着需要在培养液中添加多四环素和cumate以诱导LV的产生(图1A)。而Gag/Pol 在CMV启动子控制下。即使Gag / Pol的表达是结构性的,并且不由开关直接控制,但其表达仍取决于REV响应元件(RERE Responsive Element,RRE)的存在。然后构建包含产生LV的所有元件(包括基因组RNA)的细胞系(称为生产者)。为了便于滴定测定,我们选择构建表达GFP的慢病毒载体,并且其由强组成型CMV启动子调控。可通过包含RRE的pCSII-CMV5-GFPq质粒共转染包装细胞系来实现。并且先前已经报道了关于质粒构建的细节。将生产细胞系命名为clone 92。为了验证clone 92生产慢病毒的稳定性,将细胞在摇瓶中培养10周,并在不同的时间点诱导,检测慢病毒的生产。整个过程中,慢病毒滴度均维持在3.0×106TU/mL以上,表明clone 92是稳定的(图1B)。

  图1:Clone 92的cumate诱导系统和稳定性结果。A)在包装细胞系和clone 92中,Rev和包膜蛋白(VSVG)的转录受四环素和cumate开关的控制;需在培养液中添加四环素和cumate才可诱导慢病毒载体的产生。Cumate可阻止cumate阻遏物(CymR)与cumate操纵子(CuO)结合。多西环素促进四环素反式激活因子(rtTA2s-M2)与四环素启动子(TR5)的结合。B)为了检测clone 92的稳定性,细胞在无选择性培养液中悬浮培养10周,并且在培养第2周,第6周和第10周后,取部分细胞,当细胞密度达到1.0×106个/mL时,加入多西环素和cumate。通过基因转移分析法(GTA)分析诱导后48h病毒的生成量(误差线未标准偏差)。

  在所有的灌流实验中,合并收获物并将含有慢病毒载体的上清液置于冰上或4℃直至澄清(每天一次),随后储存在-80℃直至GTA分析。由于在研究中使用了两种规格的生物反应器,因此每升培养液中病毒滴度的总量(TU/L)可进行直接比较。

  在已描述的稳产贴壁细胞系中,病毒滴度在1×106至1.5×108 范围内。然而,贴壁细胞系在大规模生产中存在明显的局限性。本研究中,包装细胞系和稳产细胞系的母细胞系(HEK293SF3F6)已适应无血清悬浮培养28。使用双开关系统,即需要添加两种诱导剂才可启动病毒的合成,这是clone 92成功的一个关键因素,并且严格控制了慢病毒毒性因子的产生。在早期研究中,曾尝试过只使用一个开关,但未获得成功(结果未列出)