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包膜病毒

注意事项:可使用PBS缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液

  TU/mL,即每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数。如:病毒滴度为1×108 TU/mL即每毫升病毒液中至少含有1×108个具有生物活性的慢病毒颗粒。慢病毒的病毒滴度(

  MOI值会有所不同。建议在正式实验前,在目的细胞中进行预实验摸索最佳MOI值(维真生物)。为了节省病毒,推荐使用

  最安全的慢病毒载体。但操作者在实验中仍需保持高度警惕,严格按照以下操作规范进

  胞数,计算3个重复孔内的总数之和并计算出平均数,假设为A(倒数第二个能见荧光孔的荧光细胞平均数)和B(倒数第一个能见荧光孔的荧光细胞平均数)。慢病毒病毒滴度计算公式:病毒滴度

  进行慢病毒感染实验时可使用完全培养液(培养目的细胞用)稀释。培养液中的血

  24小时后,更换培养液。注意事项:换液具体时间需视细胞状态而定。如果慢病毒对细胞有明显毒性作用,影响细胞生长状态,最短可于加病毒4小时后更换新鲜培养液后继续培养。5.

  )慢病毒表达较慢,荧光表达所需时间较长,建议感染96小时后观察荧光的表达。2

  )若慢病毒对目的细胞的感染效率较低,可通过提高MOI值提高病毒的感染效率,也可在培养液中加入助感染试剂ADV-HR(详见附录1、附录4、附录5)来提高病毒的感染效率。4.

  离心病毒时,应使用密封性好的离心管,或用封口膜封口后进行离心,请尽量使用组织培养室内的离心机。9.

  12-24小时后观察细胞状态以确认加入的病毒量是否合适。(三)慢病毒滴度测定

  第五天荧光计数和滴度计算用荧光显微镜对荧光阳性细胞进行计数。数出最后两个能观察到荧光的孔内的荧光细

  )感染后的细胞可以连续培养一周,通过观察荧光表达的时间和强度来确定慢病毒对目的细胞的感染情况。3

  用显微镜观察细胞感染情况时,请先拧紧培养瓶或盖紧培养板,用70%乙醇擦拭培养瓶外壁后,显微镜下观察拍照。观察完毕,请用70%乙醇再次擦拭显微镜实验台。8.

  对共用实验室的人员需进行慢病毒安全培训或提示。(二)慢病毒感染目的细胞预实验

  96孔板中,细胞融合率为50%为最佳。为保证细胞生长良好,请保证细胞贴壁过夜。2.

  MOI值,用培养液准确稀释慢病毒原液。注意事项:可使用PBS缓冲液或无血清培养液稀释病毒原液。3.

  24孔培养板接种若干孔,每个孔内接种3-5×104个HEK 293细胞,铺板时细胞的融合率为50%左右,每孔培养液体积为300μL,进行病毒感染时细胞的融合率约为70%左右。2.

  TU/mL)可根据荧光蛋白在HEK293细胞中表达量确定,具体操作步骤如下:1.

  .第二天病毒的稀释和感染。在Eppendorf管中做10倍梯度稀释。稀释方法为:每种病毒准备8个1.5mL Eppendorf管,每管加入297μL完全培养液,向第一个管中加入33μL病毒原液,混匀后,吸取30μL加入第二个管混匀。依此类推,做8个稀释度(10~10-6)。弃去96孔板中原有的培养液,每个稀释度重复3个孔,每孔加入含稀释好的病毒液100μL。并做好标记。实验预览如图:

  被病毒污染的超净工作台,请立即用加入1% SDS的70%乙醇溶液擦拭干净;请务必将接触病毒的枪头、离心管、培养板、培养液使用新配制的10%漂白粉、84消毒液或0.6%

  10μL慢病毒原液加入90μL培养液中做1:100稀释(10-2)


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